Livraison de gènes sous-piaux dans la moelle épinière de souris pour évaluer l’expression des gènes

Résumé

Source : Tadokoro, T., et al. Administration du vecteur du virus adéno-associé sous-pial 9 (AAV9) chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre une technique d’injection sous-piale pour l’administration de gènes à la moelle épinière chez la souris. La procédure consiste à exposer la dure-mère, à perforer la pie-mère et à injecter un virus adéno-associé recombinant (rAAV) portant un gène exprimant une protéine fluorescente dans l’espace sous-pial. Après l’injection et la récupération, le virus facilite l’expression des gènes dans les cellules de la moelle épinière, ce qui permet d’étudier l’expression des gènes cibles.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation animale et chirurgicale générale

1. Avant de commencer l’intervention chirurgicale, décongelez le virus (AAV9-UBI-GFP [UBI : Ubiquitin Promoter, GFP : Green Fluorescent Protein] ; 5 μL aliquotes). Préparez une solution de dextran à 5 % (10 000 MW) en mélangeant de la poudre de dextran dans de l’eau distillée. Mélanger la solution virale avec une solution de dextran à 5 % 1:1 jusqu’à une concentration finale de dextran de 2,5 %.
   1. Stockez la solution virale sur de la glace (4 °C).
2. Utilisez des souris C57BL/6J adultes (mâles et femelles, 20-30 g). Anesthésiez les souris à l’aide d’isoflurane à 5 % (en O₂, 1 L/min) et maintenez-les à 2-3 % d’isoflurane inhalé (en O₂, 1 L/min) par cône nasal pendant la chirurgie, en fonction de la fréquence respiratoire et de la réponse par pincement de la patte.
3. Rasez le dos des animaux avec une tondeuse à raser et nettoyez la peau avec de la chlorhexidine à 2 %.
4. Dans les études de récupération chronique, suivez une technique stérile stricte.
5. Si des injections sous-piales lombaires doivent être effectuées, coupez la peau recouvrant les vertèbres Th8-L1 avec un scalpel et détachez le muscle paravertébral des vertèbres vertébrales Th10-12 à l’aide de ciseaux.
   1. Montez l’animal dans un cadre stéréotaxique standard à l’aide de pinces pour souris épinières.
   2. Rasez les deux côtés du limbe des vertèbres Th10-12 à l’aide d’une perceuse dentaire (foret : 0,9 mm, vitesse : 20 000 tr/min) jusqu’à ce que des fissures apparaissent.
   3. Retirez les fragments d’os fissurés à l’aide d’une pince et exposez la surface dorsale de la moelle épinière lombaire.
   4. Ouvrez la dure-mère d’environ 1 cm à l’aide d’une aiguille en acier inoxydable de 30 G et d’une pince.

2. Ouverture de la membrane piale et insertion de l’aiguille sous-piale pour l’administration AAV9

1. Montez l’aiguille pia-pénétrante 34 G dans le bras en Z d’un manipulateur XYZ à l’aide d’un support capillaire en verre (Figure 1A et B).
   REMARQUE : Pour fabriquer l’aiguille pia-pénétrante, la pointe biseautée d’origine de l’aiguille 34G est affûtée à l’aide d’une chanfreineuse capillaire en verre avec plaque abrasive diamantée - grossière (pointe de 5,0 μm à 50 μm tailles) et un angle de meulage de 15 à 20°. La pointe de l’aiguille (1 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite légèrement pliée à environ 90° (Figure 1B, insert gauche).
2. À l’aide d’une lunette de dissection chirurgicale réglée sur un grossissement de 8-10X, pénétrez la lotte avec l’aiguille d’environ 1 mm (Figure 1C) à l’aide de l’arceau en X.
   1. Maintenir l’angle de l’aiguille pénétrante par rapport à la surface du tissu à 5-10°.
3. Après l’ouverture de la pia, retirez l’aiguille pénétrant la pia horizontalement de l’espace sous-pial (Figure 1D) à l’aide du bras X.
   REMARQUE : N’oubliez pas le site pénétré par un point de repère, tel qu’un vaisseau sanguin.
4. Chargez une aiguille d’injection émoussée 36G avec le virus AAV9-UBI-GFP à l’aide d’une microseringue de 50 μL reliée à l’aiguille d’injection avec un tube PE-10 ou PE-20.
5. Montez l’aiguille dans le bras en Z d’un deuxième manipulateur XYZ (figures 1A et B) à l’aide d’un support capillaire en verre (Figure 1B, insert droit).
   REMARQUE : Pour fabriquer l’aiguille d’injection sous-piale AAV9, la pointe émoussée d’une aiguille de 36 G est polie à l’aide d’un chanfreineur capillaire en verre avec une plaque abrasive diamantée grossière (tailles de pointe de 5,0 μm à 50 μm) pour éliminer les arêtes vives. La pointe de l’aiguille (2-3 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite légèrement pliée à environ 90°. Les aiguilles d’injection pia-pénétrante et sous-piale sont insérées dans un tube en acier inoxydable esclave 20G de 1 à 2 cm de long (à 10 mm de l’extrémité de l’aiguille) et collées avec de l’époxy. L’utilisation d’un tube de 20 G (0,91 mm de diamètre) est nécessaire pour une fixation sûre au support capillaire en verre.
6. En manipulant les bras X, Y et Z du deuxième manipulateur, positionnez l’extrémité de l’aiguille d’injection AAV9 dans le site pénétré par la pie, puis avancez-la d’environ 2 à 3 mm dans l’espace sous-pial à travers l’ouverture précédente de la membrane piale à l’aide du bras en X (Figure 1E et F).
   REMARQUE : 1) L’AAV9-UBI-GFP est préparé conformément aux protocoles précédemment rapportés, et les titres finaux sont ajustés à 1,2 x^{10 13} copies du génome par mL (gc/mL). 2) Il n’est pas nécessaire de marquer l’emplacement de l’ouverture piale car elle est facilement identifiable (Figure 1D).
7. Injecter l’AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 ou 5 μL) dans l’espace sous-pial à l’aide d’une microseringue de 50 μL (voir le tableau 1 pour les groupes expérimentaux).
8. Retirez l’aiguille d’injection de l’espace sous-pial une fois l’injection de l’AAV9-UBI-GFP terminée.
9. Fermez le muscle et la peau à l’aide d’une suture monofilament 4.0 et de clips chirurgicaux.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de sceller la vertèbre ouverte.
10. Laissez les animaux récupérer sur un coussin chauffant.
11. Pour contrôler la douleur, injecter de la buprénorphine 0,05 mg/kg/sc toutes les 12 h pendant 2 à 3 jours après la chirurgie.

Tableau 1 : Groupes expérimentaux. Toutes les expériences ont été réalisées sur des souris C57BL/6J adultes.

Groupes expérimentaux	Site/niveau d’administration de l’AAV9 (*)	Volume de l’AAV9 inj, débit de perfusion Temps de	survie	Analyse tissulaire
Groupe A (n = 7)	C2 (bilatérale)	5 μL/5 min	14 jours	Cerveau + moelle épinière
Groupe B (n = 12)	L1-L2 (bilatérale)	1,5 μL ou 3 μL, 60 sec/μL	14 jours	Cerveau + moelle épinière
Groupe C (n = 6)	C2 + L1-L2 (bilatéral à chaque niveau)	5 μL/5 min	14 jours	Moelle
* - bilatérale = deux injections sous-piales, l’une administrée dans l’espace sous-pial droit et l’autre dans l’espace sous-pial gauche du ou des segments injectés.

épinière

Résultats

Figure 1 : Configuration expérimentale pour effectuer des injections sous-piales vertébrales chez une souris adulte. (A) Pour effectuer des injections sous-piales vertébrales chez les souris adultes...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6J Souris	Jackson Labs	664
Stéréotaxie standard de laboratoire pour souris	Appareil Harvard	72-9568
Adaptateur de colonne vertébrale souris	Appareil Harvard	72-4811
XYZ Manipulateur	Stoelting	51604
Pompe à perfusion manuelle	Stoelting	51218
34G Aiguille Nanofill biseautée	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Aiguille Nanofill Blunt	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Solution de chlorhexidine	MWI Veterinary Supply	501027
20G Aiguille en acier inoxydable	Becton-Dickinson	305175
23G Aiguille en acier inoxydable	Becton-Dickinson	305145
30G	Becton-Dickinson	305128
Applicateur	à pointe de cotonMWI Veterinary Supply	27426
Verre Capillaire Chanfreineur	Narishige International	SM-25B
Microscope à lames Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microseringue	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tube	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 suture monofilament	VetOne	V1D397
Verre Capillaire Chanfreineur	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory